2024年2月29日，云南大学陈大华教授团队及其合作者在Cell Press旗下知名学术期刊Cell Reports在线发表了题为“The TET-Sall4-BMP regulatory axis controls craniofacial cartilage development”的研究论文，发现TET家族蛋白（TET2、TET3）和转录因子Sall4发生共同相分离形成凝聚体，调控BMP信号通路活性，从而影响外胚层间充质细胞向软骨细胞的分化。TET-Sall4-BMP调控轴在胚胎发育的颅面软骨发生中发挥关键功能。

颅面短小症（Craniofacial Microsomia, CFM）是一种常见的先天性多系统发育畸形，发病率高达1/5000以上，患者多表现为耳部和下颌骨的发育异常。目前，该病的临床表型复杂、发病机制尚不明确。近年来，有病例报道称携带特定Ten-eleven translocation（TET）基因变异型的患者表现出典型的颅面畸形症状。DNA双加氧酶TET家族蛋白作为重要的表观遗传调控因子，可介导5-甲基胞嘧啶（5-mC）转化为5-羟甲基胞嘧啶（5-hmC）。关于TET蛋白是否参与调控颅面发育进而与CFM发病相关联则仍然未知。

为了揭示这一问题，研究人员以斑马鱼为动物模型，分别构建了TET家族成员TET1/TET2/TET3的单突变体以及3种双纯合突变体。结合突变体以及morpholino介导的基因敲降实验进行表型分析，发现TET2/3同时缺失会导致明显的下颌软骨发育畸形。基于普通转录组测序以及单细胞转录组测序数据的分析表明，TET2/3缺失不仅引起了剧烈的基因表达变化，更严重影响了斑马鱼胚胎中的细胞谱系发育。以显著受干扰的软骨发生过程为例：外胚层间充质细胞（Ectomesenchymal cells，EMCs）来源于神经嵴细胞，部分外胚层间充质细胞将进一步分化为软骨细胞；拟时序分析显示TET2/3缺失导致这一过程受到阻遏无法正常进行。EMC的谱系发育受到包括Wnt，FGF，BMP等在内的多个信号通路调控，而当TET2/3缺失后，BMP通路相关组分的表达受影响更为显著。遗传学证据表明，过表达Bmp4或Smad1CA均可明显回复因TET2/3缺失导致的下颌软骨畸形。以上结果证明TET2/3通过影响BMP信号通路活性来控制软骨细胞分化。

接下来，研究者利用hMeDIP-seq，BS/ox-BS-seq等技术构建了斑马鱼胚胎精细的全基因组5hmC分布图谱。相较于野生型样本，当TET2/3敲降后导致Bmp4启动子特定区域的5hmC peak消失。通过分析序列的motif特征然后进行DNA探针pull-down靶蛋白质谱鉴定技术，推测转录因子Sall4可能是调控Bmp4表达的关键蛋白。基于原位杂交以及表型分析的证据显示Sall4表达模式与Bmp4高度类似，Sall4缺失会导致下颌软骨畸形以及Bmp4表达显著下调，过表达Bmp4则可以明显回复因Sall4缺失导致的表型。由此推断Sall4也可能通过Bmp4参与调控下颌软骨发育。此外，Sall4偏好性结合5mC/5hmC修饰的DNA分子，意味着Sall4与TET介导的5mC/5hmC转化过程存在关联。

为阐明更深入的分子机制，研究者通过ddFP系统结合活细胞显微成像实验观察到Sall4不仅自身可以凝聚形成小颗粒，当DNA分子存在时，Sall4还能快速发生相变形成更大的颗粒。有意思的是，TET2或TET3自身难以聚集，而Sall4的存在会分别促进Sall4-TET2和Sall4-TET3发生共同相分离形成大的凝聚体，并且Sall4蛋白的ZFC1结构域对共同相分离的发生起关键作用。通过这一过程，TET-Sall4共同调控Bmp4表达。综上，该研究揭示了TET-Sall4-BMP调控轴控制颅面软骨发育的详细分子机制，对于理解CFM的发病机制和诊断筛查具有重要意义。

云南大学博士研究生王伟刚、杨娜、王亮亮为论文的并列第一作者，云南大学陈大华教授、章文信副教授，华南理工大学王强教授、昆明医科大学附属口腔医院王卫红教授为论文的共同通讯作者。本项目得到国家自然科学基金基础科学中心项目的资助。

论文链接：

https://www.cell.com/cell-reports/fulltext/S2211-1247(24)00201-8

来源：云南大学网页

供稿：生物医药研究院

编辑：党委统战部

陈大华：无党派人士，生物医院研究院 教授